Возможности использования копрологического теста на димерную М2-Пируваткиназу (Tumor M2-PK) в скрининге колоректального рака
Огнерубов Н.А., Милованов В.В., Иванников А.А., Ежова Е.Н.
Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина
Тамбовский областной онкологический клинический диспансер
В статье приведены результаты определения в кале концентрации опухолевой М2 – пируваткиназы при некоторых злокачественных новообразованиях у 42 пациентов. В среднем у лиц контрольной группы уровень ее составил 2,18 Ед/мл., а при колоректальном раке — 6,97 Ед/мл., различия статистически достоверны.
Ключевые слова: опухолевая М2 – пируваткиназа, злокачественные новообразования, копрологический тест..
Введение: пируваткиназа играет важную роль в процессе гликолиза в активно пролифелирующих и опухолевых клетках. Она существует в виде различных изоформ, характеризующихся тканеспецифичностью (L, R, M1, M2). Пируваткиназа типа L обнаружена в печени и проксимальных почечных канальцах, типа R — в эритроцитах, типа М1 — в мышцах и мозге, и типа М2 — в легких. Причем, пируваткиназа М2 – типа является филогенетически более древней формой. В активной форме все изоформы фермента состоят из четырех идентичных субъединиц, т.е. являются тетрамерами. Изофермент М2 – пируваткиназы может существовать в высоко активной тетрамерной форме и почти неактивной димерной форме. Соотношение тетрамерной и димерной форм пируваткинаыа в пролифелирующих клетках определяет, будет ли глюкоза деградировать в лактат с продукцией энергии, или произойдет отведение пути ее метаболизма в сторону синтетических процессов. Соотношение тетрамер/димер для М2 — пируваткиназы контролируется онкобелками и промежуточными продуктами метаболизма. При возникновении опухоли количество исходных тканеспецифичных изоэнзимов снижается, и опухолевые клетки начинают вырабатывать в большом количестве пируваткиназу типа M2. При этом, изоэнзим, который изначально состоял из 4-х субъединиц, расщепляется до димера, имеющего более низкую активность. Димерная форма М2-пируваткиазы, характерная для опухолевых клеток, получила название опухолевой М2-пируваткиназы. В опухоли, где процесс клеточного деления идет очень активно, клетки предпочитают так называемый «метаболический шунт» с целью сохранения энергии. Димеризация М2-пируваткиназы происходит путем фосфорилирования или вследствие прямого связывания онкобелков и приводит к снижению активности энзима, аналогично как и в случае с глюкозой при синтезе нуклеиновых кислот, фосфолипидов и аминокислот. Пируавткиназа М 2 – типа считается ключевым регулятором изменения метаболизма в опухолевых клетках. Она поступает в кровь, фекалии, что позволяет использовать этот параметр в качестве онкомаркера в лабораторной диагностике.
Роль этого фермента изучена в качестве онкомаркера при опухолях пищеварительного тракта, молочной железы, легких, почек [1, 8], острых и хронических воспалительных процессах, особенно толстого кишечника. [3, 4, 5, 7, 9, 10, 11]. Чувствительность и специфичность этого метода составили, соответственно, 60-80 % и 80-90 % [1, 2, 6]. Повышение уровня М2 — пируваткиназы наблюдается также при острых и хронических воспалительных процессах, заболеваниях сердца, сахарном диабете и др. [10, 11].
Так, установлено значительное повышение концентрации М2- пируваткиназы у больных с тяжелой и среднетяжелой формами неспецифического язвенного колита, в стадии обострения по сравнению с периодом ремиссии [2]. Уровень М2 — пируваткиназы в крови пациентов с хроническим непрерывным течением при неспецифическом язвенном колите был почти в два раза выше по сравнению с таковыми при хроническом рецидивирующем течении [4, 5, 7].
Концентрация М2 – пируваткиназы в кале больных колоректальным раком значительно выше, чем у здоровых лиц или пациентов с аденоматозными полипами и коррелирует с размерами и степенью злокачественности опухоли [14, 16]. По данным Земляного В.П. и соавт. (2005), Kаri J. et all. (2008) пируваткиназа М2 – типа обладает высокой чувствительностью и стадиоспецифичностью, поэтому может быть использована в качестве предиктора эффективности лечения колоректального рака [13, 15].
В настоящее время фекальный тест определения М2 — пируваткиназы применяется как скрининг-тест колоректального рака в группах риска [12].
Целью работы явилось определение уровня опухолевой М2 – пируваткиназы в кале при некоторых злокачественных новообразованиях.
Материалы и методы.
Концентрацию опухолевой М2 – пируваткиназы определяли в кале (копрологический тест) с помощью диагностического набора фирмы ScheBo Biotech АG. Исследование проводили на автоматическом микропланшетном фотометре «Sunrise» фирмы TECAN (США) с микропроцессорным управлением с использованием вошера «ТЕСAN» (США).
На поверхность лунок планшета для ИФА наносились первые моноклональные антитела, специфичные только к опухолевой М2-пируваткиназе. Опухолевая М2 — пируваткиназа, присутствующая в образце кала пациента, или стандарт для опухолевой М2 — пируваткиназы из набора для ИФА связываются с этими антителами и, таким образом, иммобилизуются на планшете. Моноклональные антитела второго типа (коньюгированные с биотином) связываются с опухолевой М2 — пируваткиназой в течение следующей инкубации. Затем добавляли коньюгат пероксидазы хрена со стрептавидином, который связывается с биотином антител второго типа. Пероксидаза хрена окисляет субстрат — ТМВ (3,3,5,5 — тетраметил бензидин), который приобретает желтый цвет. В заключении концентрацию окисленного ТМВ определяют фотометрически.
Данный набор ИФА позволяет определить концентрацию опухолевой М2 – пируваткиназы в пределах от 1 до 20 Ед/мл, а дискриминационный уровень равен 4 Ед/мл. Погрешность интра-исследования опухолевой М2 – пируваткиназы была измерена посредством 20-кратного анализа 5 образцов кала (3,8 – 19,7 Ед/мл). Среднее значение коэффициента вариации составило 5,3 % (3,0 — 7,9 %).
Материалом для исследования послужили образцы кала 31 пациента, страдающих злокачественными новообразованиями различных локализаций, в возрасте от 38 до 76 лет, медиана возраста составила 47, 7 + 2,7 лет. Мужчин было 11 (35,5 %), а женщин – 20 (64,5 %). У всех больных диагноз злокачественного новообразования подтвержден морфологически. В качестве контроля использовались образцы кала от 11 практически здоровых лиц в возрасте от 38 до 65 лет, медиана возраста 44, 6 + 2,4 лет. Все больные были разделены на 3 группы.
Первая группа представлена пациентами, страдающими различными хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта в стадии ремисии, а именно, эзофагитом, гастритом и колитом (исключая неспецифический язвенный колит). Медиана возраста – 46,1 + 2,8 лет (35 – 62).
Пациенты второй группы (13) на момент исследования имели установленный диагноз злокачественного новообразования (вторая клиническая группа). Среди них колоректальный рак диагностирован у 7 больных, рак яичников — у 3, рак молочной железы, меланома и рак языка по 1 случаю. Медиана возраста в этой группе составила 43,3 + 2,1 лет (43 – 73).
Третьею группу составили больные (8 человек), которым проведено специальное лечение по поводу колоректального рака, рака почки и поджелудочной железы (третья клиническая группа). Медиана возраста была равна 54,7 + 3,1 лет (43 – 76).
Результаты и обсуждение.
Уровень фекальной опухолевой М2 — пируваткиназы у пациентов различных групп, включая контроль, представлен в таблице 1.
Табл. 1.
Уровень опухолевой М2 – пируваткиназы у пациентов различных групп.
Группа Количество больных Среднее значение, Ед/мл Интервал, Ед/мл
1 10 3,35+0,62 2,15 – 4,31
2 13 6,97+0,86 3,47 – 15,9
3 8 3,47+0,64 1,17 – 5,95
Контроль 11 2,18+0,39 1,51 — 4,01
У лиц контрольной группы уровень опухолевой М2 – пируваткиназы более 50 % случаев был меньше 2 Ед/мл, и только лишь в 4 случаях он превышал этот показатель, составляя в среднем 2,18 + 0,39 Ед/мл.
У больных, страдающих заболеваниями желудочно-кишечного тракта (1 группа), уровень опухолевой М2 – пируваткиназы колебался от 2,15 до 4,31, в среднем — 3,35 + 0,62 Ед/мл. У 6 пациентов он превышал 3 Ед/мл.
Весьма интересные результаты были получены у лиц с установленным диагнозом злокачественного образования (2 группа). При этом концентрация опухолевой М2 – пируваткиназы колебалась от 3,47 до 15,9 Ед/мл, в среднем она была равна 6,97 + 0,86Ед/мл. Относительно лиц контрольной группы различия статистически достоверны (р ˂ 0,05). Как указывалось выше, в эту группу входили 7 пациентов, страдающих колоректальным раком. Колебания уровня опухолевой М2 – пируваткиназы у них были от 3,61 до 15,9 Ед/мл, составляя в среднем 8,28 + 0,94 Ед/мл. Различия в показаниях средних значений концентраций, при этом, относительно всех групп пациентов, статистически достоверны (р ˂ 0,05).
Что касается больных 3 группы (лица, находящиеся на диспансерном наблюдении), то средняя концентрация фекальной опухолевой М2 – пируваткиназы у них составила 3,47 + 0,64 Ед/мл и практически не отличается от пациентов 1 группы.
Полученные нами результаты соответствуют имеющимся в отечественной и зарубежной литературе сведениям о клинической значимости пируваткиназы типа М2 при диагностике целого ряда злокачественных новообразований, включая скрининг колоректального рака. Считается, что этот тест является более чувствительным и специфичным, особенно у лиц с высоким риском развития заболевания.
Выводы:
1. Опухолевую М2 – пируваткиназу можно обнаружить и количественно определить в человеческом кале.
2. Концентрация фекальной опухолевой М2 – пируваткиназы существенно колеблется при различных злокачественных новообразованиях. При этом, значительно более высокий уровень ее наблюдается у больных колоректальным раком.
3. Определение опухолевой М2 – пируваткиназы возможно применять при организации диспансерного наблюдения за онкологическими больными.
Литература:
1. Диагностика содержания в плазме крови опухолевой пируваткиназы М2 типа (ТuМ2-РК) на этапах диагностики, лечения и мониторинга больных колоректальным раком / [Н.С. Сергеева, М.П. Мишунина, В.М. Хомяков и др.] // Рос. онколог. журн. – 2007. – № 5. – С. 9–12.
2. Конович Е.А. Содержание пируваткиназы типа М2 (М2-РК) в плазме крови больных воспалительными заболеваниями толстой кишки / Е.А. Конович, И.Л. Халиф // Рос. журн. гастроэнтеролог., гепатолог., колопроктолог. – 2010. – № 5. – С. 75–79.
3. Fecal M2-pyruvate kinase: a novel noninvasive marker of ideal pouch inflammation / [M.W. Johnson, S. Maestranzi, A.M. Duffy et al.] // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. – 2009. – Vol. 21, № 5. – P. 544–550.
4. Fecal M2-pyruvate kinase(M2-PK): a novel marker of intestinal inflammation / [G. Chung-Faye, B. Hayee, S. Maestranzi et al.] // Inflamm. Bowel. Dis. – 2007. – Vol. 13. – P. 1374–1378.
5. Fecal pyruvate kinase: a potential new markers for intestinal inflammation in children with inflammatory bowel disease / [E. Czub, K.H. Herzing, A. Szaflarska-Popawska et al.] // Scand. J. Gasnroenterol. – 2007. – Vol. 42, № 10. – P. 1147–1150.
6. Hang U. Sensitivity and specificity of fecal, tumor M2-pyruvate kinase for detection of colorectal adenomas in a large screening study / U. Hang, S. Hundi, H. Brenner // Br. J. Carcer. – 2008. – Vol. 99, № 1. – P. 133–135.
7. Jeffery J. Fecal dimeric M2-pyruvate kinase (tumor M2-PK) in the differential diagnosis of functional and organic bowel disorders / J. Jeffery, S.J. Lewis, R.M. Ayling // Inflamm. Bowel. Dis. – 2009. – Vol. 15, № 11. – P. 1630–1634.
8. Increased rectal mucosal enteroendocrine cells, T-lymphocytes, and increased gut permeability following acute Campylobacter enteritidis and in post-dysenteric irritable bowel syndrome / [R.C. Spiller, B. Jenkins, J.P. Thornley et al.] // Gut. – 2000. – Vol. 47. – P. 804–811.
9. Shih D.Q. Immunopathogenesis of inflammatory bowel disease / D.Q. Shih, S.R. Targan // World J. Gastroenterol. – 2008. – Vol. 14. – P. 390–400.
10. Staib P. Plasma levels of tumor M2-pyruvate kinase should not be used as a tumor markers for hematological malignancies and solid tumors / P. Staib, M. Hoffmann, T. Schinkothe // Clin. Chem. Lab. Med. – 2006. – Vol. 44, № 1. – P. 28–31.
11. Tumor markers pyruvate kinase type tumor M2 in patients suffering from diabetic nephropathy / [G. Oremek, F. Rutners, N. Sapoutzis et al.] // Anticancer Res. – 2003. – Vol. 23. – P. 1155–1158.
12. Старостина М.А., Афанасьева З.А, Зинкевич О.Д., Сафина Н.А. Информативность методов скрининга у больных раком толстого кишечника// Казанский медицинский журнал. – 2011. – Т. 92.№ 1.- С. 20 -21.
13. Земляной В.П. , Трофимова Т.Н., Нипомнящая С.Л., Дементьева Т.В. Современные методы диагностики и оценки степени распространенности рака ободочной и прямой кишки//Практ.онкол. – 2005.- Т. 6. — № 2. – С. 71 — 80.
14. Hardt P.D., Mazurek S.,Toepler M. et al. Faecal tumour M2 pyruvate kinase: a new sensitive screening tool for colorectal cancer.// Brit. J. Cncer,- 2004. – Vol. 91. – P. 980 – 984.
15. Karl J., Wild N., Tacke M. et al. Improved diagnosis of colorectal cancer using a combination of fecal occult blood and novel fecal protein marcers// Clin. Gastroenterol. Hepatol. – 2008. – Vol. 6 (10). – P. 1122 – 1128/
16. Levi Z., Rozen P., Hazazi R. et al. A quantitative immunochemical fecal occult blood test for colorectal neoplasia// Ann. Intern. Med. – 2007. – Vol.20.-P.244–255.